Description

• Title:
  Analiza właściwości wybranych preparatów roślinnych w kontekście patogenezy zakażeń o etiologii Staphylococcus aureus
• Creator:
  Paszkiewicz, Małgorzata
• Contributor:
  Uniwersytet Łódzki, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej;
  mpasz@biol.uni.lodz.pl
• Description:
  Jednym z najpowszechniejszych patogenów, wykazujących niezwykłe zdolności przystosowawcze oraz predyzpozycje do nabywania oporności na większość znanych klasycznych antybiotyków, jest gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus). Obecnie coraz więcej zainteresowania poświęca się alternatywnym terapiom zakażeń z udziałem tego drobnoustroju. Przedmiot badań w prezentowanej pracy stanowiły preparaty pochodzenia roślinnego bogate w związki polifenolowe, które w założeniu miałyby być wykorzystane jako preparaty bójcze lub wspomagające działanie klasycznych antybiotyków w zakażeniach o etiologii S. aureus, w tym w przewlekłych zakażeniach ran, również o podłożu biofilmowym. Analizie poddano sześć ekstraktów naturalnych: z liści borówki czernicy (Vaccinium myrtillus), ziela pięciornika gęsiego (Potentilla anserina), ziela rozmarynu lekarskiego (Rosmarinus officinalis), ziela serdecznika pospolitego (Leonurus cardiaca), łusek cebuli żółtej (Allium cepa), kory kruszyny (Frangula alnus) oraz sześć ich wybranych składników należących do fenoli i terpenów: kwas galusowy, tymol, karwakrol, kemferol, kwas oleanolowy, kwas ursolowy. Nowatorskie podejście do badań zakładało kompleksową analizę preparatów roślinnych, zarówno pod kątem ich działania przeciwgronkowcowego (również w połączeniu z antybiotykami), w tym potencjału przeciwbiofilmowego, jak i aktywności immunomodulującej w stosunku do komórek zaangażowanych w proces gojenia się ran. Dokonano analizy farmakodynamicznej preparatów roślinnych, badając kinetykę ich działania przeciwbakteryjnego oraz trwałość efektu po ich usunięciu ze środowiska drobnoustrojów (efekt poekspozycyjny). Określono również wpływ obecności preparatów roślinnych na cechy fenotypowe S. aureus istotne w patogenezie zakażeń (m. in. tolerancję na stres oksydacyjny, zmiany charakteru powierzchni komórek, ekspresję i uwalnianie wybranych czynników wirulencji). Niezwykle istotnym aspektem zakażeń przewlekłych jest udział w nich biofilmów bakteryjnych, opornych na niesprzyjające warunki środowiska. Badano więc zdolność preparatów roślinnych do osłabiania adhezji i tworzenia biofilmu, jak również usuwania (eradykacji) już utworzonej struktury biofilmu. Mając na uwadze ewentualne przyszłe zastosowanie fitopreparatów we wspomaganiu klasycznych antybiotyków dokonano również oceny występowania zjawiska synergizmu działania fitozwiązków z antybiotykami, również wobec biofilmów S. aureus. Ze względu na potencjalne wykorzystanie badanych fitopreparatów w terapii zakazeń ran, ważnym aspektem było prześledzenie ich aktywności immunomodulującej w stosunku do komórek skóry (fibroblastów i keratynocytów). Badania tej części dotyczyły wpływu fitozwiązków na aktywność sekrecyjną komórek w zakresie produkcji cytokin/czynników wzrostu i kolagenu oraz ich zdolność do migracji/chemotaksji. W badaniach opisanych w niniejszej pracy posłużono się zróżnicowanymi metodami, uznanymi na podstawie wstępnych doświadczeń za najbardziej odpowiednie i wiarygodne. Przy ich doborze kierowano się m. in. prooksydacyjnymi właściwościami preparatów roślinnych, które mogły zaburzać odczyt wyników. Wykorzystano klasyczne metody referencyjne, jak np. metoda mikrorozcieńczeń w bulionie oraz odczyt wizualny/ocena CFU („złoty standard”). Posługiwano się również barwieniem Alamar Blue i fluorescencyjnym (Live/Dead), mikroskopią fluorescencyjną. Wielokrotnie stosowano klasyczne lub zmodyfikowane na potrzeby danej analizy metody ELISA i ELLA. Wykorzystywano też modyfikowane monocyty ludzkie linii THP1-Blue NF-κB, test gojenia się rany czy komorę Boydena (migracja komórek). Wyniki opisanych badań potwierdzają wysoką aktywność przeciwgronkowcową wybranych preparatów roślinnych, w tym tak pożądaną aktywność przeciwbiofilmową. Analiza wpływu fitopreparatów na cechy gronkowców związane z tworzeniem biofilmu wskazuje na zróżnicowane mechanizmy ich działania, co zmniejsza prawdopodobieństwo wykształcenia się na nie oporności. Potwierdzono również zdolność fitopreparatów do osłabiania wirulencji gronkowców poprzez zwiększanie ich podatności na stres oksydacyjny, a także hamowanie produkcji enzymów i toksyn. Obserwowano również zdolność fitopreparatów do nasilania przeciwgronkowcowej aktywności wybranych antybiotyków, nie tylko wobec hodowli planktonowych, ale również biofilmowych. Jednocześnie jednak zanotowano występowanie antagonizmu działania niektórych połączeń fitozwiązek/antybiotyk. Wykazano modulującą aktywność preparatów naturalnych w stosunku do komórek skóry, przy czym dla większości ekstraktów naturalnych obserwowano działanie osłabiające sekrecję białek i migrację. Może to być zjawisko korzystne lub negatywne, w zależności od fazy zakażenia/procesu gojenia się rany. Warto podkreślić, iż ekstrakty naturalne wybrane do badań w ramach niniejszej pracy dotychczas były zalecane głównie do podawania doustnego, dlatego przeprowadzona analiza ich przydatności do aplikacji miejscowej ma charakter nowatorski. Wyniki uzyskane w ramach prezentowanej pracy potwierdzają możliwość zastosowania wybranych preparatów roślinnych we wspomaganiu terapii miejscowych zakażeń o etiologii S. aureus, również o podłożu biofilmowym. Jednak z uwagi na niezwykle złożony charakter oddziaływań preparatów roślinnych oraz zróżnicowaną aktywność biologiczną, sugeruje się konieczność prowadzenia szczegółowych badań i kompleksowego do nich podejścia, celem indywidualnego rozpatrywania preparatów roślinnych jako potencjalnych terapeutyków.;
  Despite the constant development of medicine, infections caused by multidrug resistant bacteria are still a major clinical problem. One of the most common pathogens which easily adopt to the environmental conditions and acquire resistance to most antibiotics is Staphylococcus aureus. Recurrent staphylococcal infections, particularly health- and life-threatening biofilm-associated wound infections, i.a. those occurring in the case of the diabetic foot syndrome, cause serious clinical and economic problems. There is a threat that all known anti-staphylococcal therapeutics will become inefficient in the nearest future. Therefore, currently a lot of attention is being paid to alternative therapies, among which using natural products seems to be a very promising option. Their application not only as biocides, but also as agents affecting pathogens virulence or antibiotics enhancers is being considered. Polyphenol-rich plant preparations exhibiting such activities were the subject of the presented project. Although phytochemicals have been used for a long time, e.g. in ethnomedicine, more detailed investigation of their applicative potential, including the mode of action and interactions with other substances, is necessary, in order to improve their efficacy and prevent possible side-effects. The study involved six natural plant extracts from: bilberry (Vaccinium myrtillus) leaves, silverweed (Potentilla anserina) herb, rosemary (Rosmarinus officinalis) herb, motherwort (Leonurus cardiaca) herb, onion (Allium cepa) scales, alder buckthorn (Frangula alnus) bark along with their six phenol/terpene compounds: gallic acid, thymol, carvacrol, kaempferol, oleanolic acid and ursolic acid, selected from 28 extracts and 14 phytocompounds on the basis of their antibacterial and cytotoxic activity. An undeniable advantage of this project was the multidirectional approach to the examination of tested preparations, taking into consideration both, their antistaphylococcal activity (including combinations with antibiotics) and immunomodulatory properties towards eukaryotic cells involved in wound healing. The phytopreparations were tested for their kinetics (time-killing) and post-exposition effect against staphylococci. The impact on relevant pathogenic features of S. aureus, i.e. oxidative stress tolerance, cell hydrophobicity, as well as the production/release of virulence factors (α-hemolysin, enzymes, peptidoglycan (PG)) and factors involved in biofilm formation (PIA/PNAG adhesin, lipoteichoic acids (LTA)), was also assessed. Chronic infections are usually associated with bacterial biofilms. Therefore, one of the main goals of the project was the estimation of phytochemicals influence on the bacterial adhesion, biofilm formation and eradication. Taking into consideration a possible application of phytocompounds for improving the effectiveness of classic antibiotics, the synergistic effect of natural products in combination with selected antibiotics (oxacillin, vancomycin, linezolid) towards staphylococci in planktonic and biofilm cultures was also investigated. Although often neglected, the effect of drugs on the host organism also constitutes an important issue in the therapy of infections. The second direction of the study involved evaluating the immunomodulatory activity of selected phytochemicals on fibroblasts and keratinocytes, the cells which play a crucial role in the elimination of pathogens and regeneration of the skin tissue – a common site of staphylococcal infections. The influence on important cell parameters, such as the production of cytokines/growth factors (MCP-3, TGF-β1, VEGF) and collagen as well as the migration/chemotaxis was assessed. Methods used in the study were chosen in preliminary tests as the most suitable and reliable. During the selection process the oxidative properties of phytocompounds were taken into consideration as a factor possibly affecting the interprepation of obtained results. We used reference methods, such as broth microdilution method and CFU assessment („gold standard”) in MIC/MBC evaluation. Alamar Blue reduction, fluorescence staining (Live/Dead) or fluorescence microscopy (anti-adhesion/anti-biofilm activity) were also applied. ELISA and ELLA methods, in standard or modified versions (adapted for specific test requirements) were often used (LTA, HLA, PIA/PNAG release, collagen, cytokines, growth factors production). The modified human monocytic cell line THP1-Blue NF-κB, the scratch assay (wound healing test) and Boyden chambers (keratinocytes chemotaxis) were also applied. The obtained results show a significant anti-staphylococcal, including anti-biofilm, activity of selected phytopreparations. The analysis of their effect on staphylococcal features associated with biofilm formation (cell membrane permeability, hydrophobicity, LTA and PIA/PNAG production) implies diverse mechanisms of action, which guarantees the low risk of bacterial resistance development. The ability of plant products to impair staphylococcal virulence due to the increase in oxidative stress susceptibility and inhibition of the production of many enzymes and toxins was also confirmed. We observed the phytocompounds potential to enhance antistaphylococcal activity of selected antibiotics, also in the case of biofilm cultures. However, some antagonistic combinations of phytopreparations/antibiotics (e.g. gallic acid with oxacillin) were also observed. We demonstrated the immunomodulatory activity of plant preparations towards skin cells. In most cases the suppression of both the secretory activity and migration/chemotaxis was observed in the phytocompounds presence. This phenomenon may be considered as positive or negative depending on the phase of infection and the wound healing process. It is worth mentioning that, to date, the selected plant extracts have been recommended mainly for oral administration. This fact confirms the innovative character of performed investigation concerning their topical use. The results obtained in the presented study reveal the potential usefulness of selected plant extracts and their combinations with antibiotics for the treatment of staphylococcal infections, especially those associated with biofilm. However, the complex character and diverse biological activity of plant products suggest the necessity of comprehensive examination of every single preparation before its application in the therapy.;
  Finansowanie badań: Projekt badawczy Narodowego Centrum Nauki Nr 2012/05/N/NZ7/01216 „Analiza biomedyczna alternatywnej strategii leczenia ran przewlekle zakażonych. Badania in vitro z zastosowaniem polifenoli roślinnych” Dotacja celowa MNiSW dla młodych naukowców oraz uczestników studiów doktoranckich w roku 2012, 2013 i 2014
• Object availability:
  free access
• Rights:
  Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne-Bez utworów zależnych 3.0 Polska;
  http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pl
• Date:
  2016.04.27;
  2016.04;
  2016
• Type:
  PhD/Doctoral Dissertation
• Language:
  Polish
• Format:
  application/pdf
• Subject:
  Staphylococcus aureus;
  gronkowiec złocisty;
  biofilm;
  fitozwiązki;
  zakazenia ran;
  synergizm
• Identifier: http://hdl.handle.net/11089/17893
• Data provider:
  Repozytorium Uniwersytetu Łódzkiego
• Can I use it?:
  check license
• Type:
  text